Истoчник: A. H. Chen, D. Lubkowicz, V. Yeong, R. L. Chang & P. A. Silver. Систeмa циaнoбaктeрий тaкaя прoстaя и нeприxoтливaя и спoсoбнa рaбoтaть кaк минимум нeскoлькo сутoк дaжe в oтсутствиe рaбoты гeнoв, чтo у биoинжeнeрoв из Гaрвaрдскoй мeдицинскoй шкoлы (Бoстoн, СШA) вoзниклa идeя внeдрить ee в кaкoй-нибудь другoй oргaнизм. В прoстeйшeм случae гeн A aктивируeт рaбoту гена Б, а тот, в свою очередь, подавляет работу гена А. Из-за нарушения суточных ритмов страдают не только путешественники после длительных перелетов. В фосфорилированном состоянии он хорошо связывается с другим белком, SasA, который, служит посредником для запуска «дневных» процессов. Чтобы навесить на себя фосфат, KaiC забирает его у АТФ и расходует эти молекулы. При делении клетки ее ДНК должна реплицироваться, и этот процесс может временно нарушить работу «генетических» часов. У цианобактерий внутренние часы работают так (рис. 1). Так можно регулировать по часам работу потенциально любых генов — если мы знаем белки, которые могут привлечь к ним полимеразу. Таким образом, чтобы сделать циркадные часы как у цианобактерий, нужны три белка, а также источник энергии — молекулы АТФ. Есть главный белок, KaiC, который способен сам на себя навешивать фосфат и сам с себя фосфаты удалять. Transplantability of a circadian clock to a noncircadian organism // Science Advance. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science Advance
Другой способ — это использовать генетические конструкции с промоторами цианобактерии, которые регулируются этими молекулярными часами в естественных условиях. Тот ген, перед которым есть такая последовательность, будет работать только в дневное время суток. Эта система напоминает биологический вариант реакции Белоусова — Жаботинского, в которой тоже происходят циклические превращения веществ. Для этого нужно пришить к KaiC одну из субъединиц РНК-полимеразы, а к SasA — белок, связывающий участок ДНК перед целевым геном. Ученые снабдили молекулярными циркадными часами бактерию, у которой не было природных циркадных ритмов. В общем, каждому живому организму — по хорошим часам! Например, у растений днем и ночью происходят разные реакции фотосинтеза, а у животных ночью включается режим экономии, отдыха и отчистки мозга от токсинов — режим сна. Оказалось, что периодичность работы системы регулируется соотношением АТФ и АДФ. Если выработка одного из генов зависит от уровня освещенности, то, ориентируясь по таким внутренним часам, клетки могут определять, какое сейчас время суток, и в соответствии с этим управлять разными процессами. Для этого нужно сделать генетические конструкции, в которых за таким специфическим ДНК-сайтом, отвечающим за работу часов цианобактерии, будет стоять ген, активность которого будет легко наблюдать. По-видимому, белки-регуляторы ориентируются именно на то, сколько АТФ или АДФ находится в растворе. На один из них навешивается субъединица РНК-полимеразы бактерий, а на другой — белок, который распознает определенную последовательность ДНК. Во-первых, можно использовать связывание фосфорилированного KaiC с белком SasA (рис. 2). У цианобактерий KaiA действует в основном на свету, а KaiB — в основном в темноте. Например, ген флуоресцентного белка, который можно увидеть глазами. Expression of a Gene Cluster kaiABC as a Circadian Feedback Process in Cyanobacteria.)
Интересно, что у вспомогательных белков KaiA и KaiB нет кофакторов, которые помогали бы им чувствовать свет, так что механизм переключения между этими двумя активаторами некоторое время оставался загадочным. Когда АТФ становится слишком мало, начинается обратный процесс — KaiC снимает с себя фосфаты и возвращает их на АДФ. К таким часам можно подключить любые гены, и их работа станет зависимой от времени суток. Так что в будущем такая система может пригодиться, чтобы стабилизировать циркадные ритмы живых организмов. Эта работа американских ученых очень интересна для будущих практических приложений. Оказывается, суточные ритмы сбиваются, например, у кишечной микробиоты, если ее хозяин нерегулярно питается. А вот на колебания фосфорилирования белков никакие изменения состояния ДНК не повлияют. Один из способов подключения гена к работе часов. Если смешать эти компоненты в пробирке, будет циклически изменяться фосфорилирование одного из белков, а период колебаний будет близок к суткам. Когда этот белок фосфорилирован, он хорошо связывается с белком SasA (на врезке толщина стрелочек соответствует силе связывания). Получить циклические колебания белков, управляемые вживленными в бактерию «часами», биоинженеры смоглиа даже двумя способами. С помощью имплантации суточных часов можно будет лечить заболевания, связанные с расстройством циркадных ритмов, или наладить адресную доставку лекарств в пораженные ткани строго по расписанию. в статье: M. Ishiura et al., 1998. Уровень фосфорилирования KaiC колеблется с суточной периодичностью. Как правило, молекулярные циркадные часы (Circadian clock) живых клеток представляют собой систему генов, соединенных петлями обратной связи. А страдания наших кишечных бактерий могут вылиться и в наши собственные страдания, потому что микробиом комплексным образом влияет на метаболизм. Первый из них стимулирует фосфорилирование KaiC, а второй — наоборот, удаление фосфата. 2. Тем более интересно, что система могла работать и в изолированном от остальной клетки виде, в пробирке, где никакие фотосенсоры цианобактерии уж точно не могли ничего подсказать ей об условиях освещения.